知识分享|生物指示剂
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引言
无菌是无菌产品质量保证的核心。无菌生产工艺经过充分验证后，才能生产出无菌产品。微生物挑战试验是无菌生产工艺验证的重要环节。而选择适当的生物指示剂则是微生物挑战试验结果获得认可的关键。下面让我们来了解下生物指示剂是什么神秘的东东，怎样选择使用呢？
灭菌是指杀灭所有形式微生物的过程。业界常用“无菌保证水平”（Sterility Assurance Level,SAL）概念来评价灭菌（无菌）工艺的效果，SAL是指产品经灭菌/除菌后微生物残存的概率。该值越小，表明产品中微生物存在的概率也就越小。为了保证注射剂的无菌安全性，国际上一致规定，采用湿热灭菌法的SAL不得大于10-6，即灭菌后微生物存活的概率不得大于百万分之一。为了保证灭菌效果能达到SAL水平，生物指示剂应运而生，因为它能综合反映影响灭菌效果的各种因素。
定义
生物指示剂（Biological Indicator，简称BI），是一类特殊的活微生物制品，可对特定灭菌工艺具有一定耐受性并能够定量测定其灭菌效力。可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等，测定灭菌效果，判定是否符合无菌保证要求。
优点
生物指示剂是用特定的微生物群和载体组合而成的，与相应的灭菌模式能够高度的耐受，指示剂内指示微生物的死亡能够真实且可靠的反应灭菌情况，反应灭菌过程中时间、温度及湿度的关系。
生物指示剂与化学指示剂的区别
化学指示剂 | 生物指示剂 |
其原理基本都是某些化学物质都是用某种化学物质作为指示剂，当环境的整体条件达到了变色的条件，化学物质就发生不可逆的颜色变化，由此而判断灭菌器有没有达到灭菌的条件。 | 简称BI，是一类特殊的活微生物制品，是对特定灭菌工艺有一定耐受性并且能够定量测定灭菌效力的微生物制剂，可用于确认灭菌设备的性能、灭菌程序的验证、生产过程灭菌效果的监控等。 |
两者的区别在于，前者验证灭菌的过程，后者则是验证灭菌的效果。即，化学指示剂通过变色能判断整体灭菌的环境有没有达到特定的条件，但具体的灭菌效果如何，需要用芽孢条做验证。 | |
指示微生物选择
为了保证验证结果的重复性，生物指示剂应当采用标准化的菌株，即变异性小，各项生物学特征均一性好的菌种，并且应当具备合乎要求的抗力。更重要的是，参照USP的要求“It must be established that thebiological indicator system provides a challenge to the sterilization processthat exceeds the challenge of the natural microbial burden in or on theproduct.”，我们应当选择比现有生产线自然环境下所发现的菌株更难杀灭的菌株来作为生物指示剂。用于灭菌验证中的生物指示剂一般是芽孢类细菌。芽孢类细菌在营养条件缺乏时，在细胞内形成圆形或椭圆形的芽孢休眠体。芽孢含水量极低，抗逆性强，能经受高温、紫外线，电离辐射以及多种化学物质灭杀等，在灭菌监测中，可利用芽孢的高抗逆性制备生物指示剂。因此针对不同的灭菌条件可选择不同的生物指示剂，依据CHP附录ⅩⅦ灭菌法中关于生物指示剂的相关要求，指示微生物必须具备以下基本要求：
① 菌种的耐受性应大于需灭菌产品中所有可能污染微生物的耐受性，即耐受性最强；
② 菌种应无致病性；
③ 菌株应稳定。存活期长，易于保存；
④ 易于培养。
若使用休眠孢子，生物指示剂中休眠孢子含量要在90%以上。
为了表征菌株的“抗力”，可参照USP<55> BIOLOGICALINDICATORS—RESISTANCE PERFORMANCE TESTS的相关标准化程序，测定D值、存活时间和杀灭时间，并提交相关的验证资料。
生物指示剂的分类
1. 按结构分可分为芽孢条生物指示剂（pore strip biological indicator)、芽孢悬浮液（pore suspension）和自含式生物指示剂(self-containedbiological indicator)；芽孢条生物指示剂需要使用阳性对照和阴性对照，而自含式生物指示剂只需要阳性对照即可。
2.根据ISO 11138 -1(2006)的分类，目前的生物指示剂有环氧乙烷灭菌用生物指示剂、湿热灭菌用生物指示剂、干热灭菌用生物指示剂、过氧化氢低温等离子灭菌生物指示剂和甲醛灭菌用生物指示剂
3.按培养时间可分为通用型生物指示剂和快速型生物指示剂。通用型生物指示剂根据芽孢复苏后指示菌种新陈代谢引起培养液pH值改变，通过酸碱指示剂变色来进行判读，时间一般在24或48小时以上；而快速型生物指示剂根据芽孢复苏后的酶促反应，通过荧光进行判读，时间一般为3-4小时。
下面简要介绍下芽孢条生物指示剂、芽胞悬浮液和自含式生物指示剂。
￡ 芽孢条生物指示剂（pore stripbiological indicator)
将芽孢条加载在载体（圆盘、滤纸、玻璃/塑料或其他材料）上，并用特定的材料包裹起来以便保持其完整性和生物活性。此类指示剂可适用于验证和监控非溶液类物品的灭菌工艺。
￡ 芽孢悬浮液（pore suspension）
芽孢悬浮液可接种于到测产品溶液或模拟产品溶液中，同时应确保溶液具有代表性。因此，将芽孢悬浮液接种于产品内部或表面能更清楚的观察产品的实际灭菌效果。需要注意的是，如果使用模拟的接种产品，则必须证明其不会降低生物指示剂的灭菌效力。
￡ 自含式生物指示剂(self-containedbiological indicator)
该类指示剂是将含有酸碱指示剂的培养基放置在玻璃安瓿瓶中，与芽孢条（pore strip）一起包装在塑料管中，实现培养基与芽孢载体分离。塑料管上方有滤纸封口的进气口，并有管帽。
其原理为，工艺灭菌部完全，有微生物残留，则经过培养，芽孢繁殖后代谢产酸性物质，培养基PH值改变，使酸碱指示剂由紫色变为黄色；若灭菌完全，培养基中PH未发生明显变化，则颜色不变。
生物指示剂的采购要求
采购生物指示剂时应要求供应商提供以下信息材料：
l 每批生物指示剂分析报告（即COA），应说明所供应生物指示剂的性能指标。
l 明确所供生物指示剂的用途，用于确定灭菌工艺的类型。
l 明确D值及其测定方法、微生物数量、所供生物指示剂效期内的效力、生产日期，有效期至、储存条件、使用说明。
l 生物指示剂使用前后注意事项，以便确保生物指示剂使用效果，以及实验人员安全和对环境的影响。
生物指示剂的活性确认
取同一批次的生物指示剂2支，将塑料瓶中的菌纸片取出一同放进1支装有4个玻璃珠和5.0ml的0.9%无菌氯化钠溶液的试管中。将试管振摇5-10分钟，直到菌纸片浸渍成浆状，再往试管中加入5.0ml0.9%无菌氯化钠溶液，再振摇1分钟。振摇完毕后立即从中吸取1.0ml溶液至0.9%无菌氯化钠溶液9.0ml的试管中，作为1号管，同法制2号管。
将1号管于80℃水浴中放置15min，作为热处理。分别将1号和2号管做连续10倍稀释（10-1、10-2、10-3），然后吸取后两个稀释级（10-2、10-3）的菌悬液1ml，各加入两个无菌平皿中，然后倒入15～20ml冷却至50℃左右的胰酪大豆东琼脂培养基，混合后待冷却。倒置平皿在56℃下培养48小时。
培养结束后，计数每个平皿碟上的菌落数，计算热处理组和未处理组各稀释液中的平均菌落数，然后计算出生物指示剂纸片上平均实际活菌数和活芽孢数。
生物指示剂合格标准：每条带菌纸片上的平均活菌数不小于制造商标明的平均数的95%，同时纸片上的活芽孢数也不小于活菌数的一半，则该批次生物指示剂判定为合格。
将结果记录在“生物指示剂的活性确认表”上，每批购买的生物指示剂均应进行本项检查。经确认批次的生物指示剂若用于验证，还应将该表附在相应的验证文件中。
生物指示剂的选择
根据不同灭菌工艺可选择相对应的适用的生物指示剂。
1、 湿热灭菌法：湿热灭菌法指将物品置于灭菌柜内利用高压饱和蒸汽、过热水喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变形而杀灭微生物的方法。灭菌能力强，为热力灭菌中最有效、应用最广泛的灭菌方法
湿热灭菌法最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子，如NCTC10007、NCIMB8157、ATCC7953。D值为1.5～3.0min，每片（或每瓶）活孢子数5×105～5×106个，在121℃、19min下应被完全杀灭。此外，还可使用生孢梭菌孢子如NCTC8594、NCIMB8053、ATCC7955，D值为0.4～0.8min。
2、 干热灭菌法：本法系指物品置于干热灭菌柜、隧道灭菌器等设备中，利用干热空气达到杀灭微生物或消除热源物质的方法。
干热灭菌法最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子，如NCIMB8058、ATCC9372。D值大于1.5min，每片活孢子数5×105～5×106个。去热原验证时使用大肠杆菌内毒素，加量不小于1000细菌内毒素单位。
3、 辐射灭菌法：指将灭菌物品置于适宜放射源辐射的γ射线或适宜的电子加速器发生的电子束中进行电离辐射而达到杀灭微生物的方法。最常用Co60射线辐射灭菌。
辐射灭菌法最常用 的生物指示剂为短小芽孢杆菌孢子，如NCTC10327、NCIM10692、ATCC27142。每片活孢子数5×105～5×106，置于放射剂量25kGy条件下，D值约3kGy。但应注意灭菌产品中所负载的微生物可能比短小芽孢杆菌孢子显示更强的抗辐射力。因此短小芽孢杆菌孢子可用于监控灭菌过程，但不能用于灭菌辐射剂量的建立。
4、 气体灭菌法：指化学消毒剂形成的气体杀灭微生物的方法，常用的化学消毒剂有环氧乙烷（EO）、气态过氧化氢、甲醛、臭氧等，适用于在气体中稳定的物品灭菌。
环氧乙烷灭菌最常用的生物指示剂为枯草芽孢杆菌孢子，如NCTC10073、ATCC9372。气态过氧化氢灭菌最常用的生物指示剂为嗜热脂肪芽孢杆菌孢子，如NCTC10007、NCIM8157、ATCC7953。每片活孢子数1×105～5×106个。环氧乙烷灭菌中，枯草芽孢杆菌孢子D值大于2.5min，在环氧乙烷浓度为600mg/l，相对湿度为60%，温度为54℃下灭菌，60min应被杀灭。
5、 过滤除茵法：利用细菌不能通过之谜具孔滤材的原理以除去气体或液体中的微生物的方法。
过滤除菌法最常用的生物指示剂为缺陷假单胞菌(如ATCC19146），用于滤膜孔径为0.22um的滤器；黏质沙雷菌（ATCC14756），用于滤膜孔径为0.45um的滤器。
一般情况下选择生物指示剂要满足两个原则：标准化菌株与合乎要求的抗力。
举例来说，实际生产过程中发现菌株的D值最高不超过0.8，如果选择选择0.8～1.5之间的生孢梭菌( Clostridium sporogenes；ATCC7955)为生物指示剂进行验证就不合适，因为在0.8的点上不能将微生物完全杀灭。因此，选择的生物指示剂的D值范围的最小值应大于实际菌株的D值得最大值时，才能确保微生物被完全杀灭，以确保无菌。同时，所选指示生物的kill time要略低于工艺灭菌时间最为适宜。
常用的生物指示剂有Bacillusstearothermophilus（嗜热脂肪芽孢杆菌）、Clostridium Sporogenes（生孢梭菌）、Bacillus subtilis （枯草芽孢杆菌）、Bacilluscoagulans（凝结芽孢杆菌）等菌种的孢子。不论采用何种验证菌株，参照USP，对湿热灭菌（121℃）的工艺验证用 菌株均应证明“具备合乎要求的抗力”；通常应满足以下要求：D值在1.5～3.0之间；存活时间在4.5～14.0min之间；完全杀灭时间在 13.5～32.0min之间。
在不明确生产过程中菌株D值的情况下应选择为目前业界常用的生物指示剂，不宜盲目选择新的指示剂。自美国NIH于1955年使用嗜热脂肪芽孢杆菌制备生物指示剂开始，由于该菌的孢子无致病性、无热原、无毒，对压力蒸汽的抵抗力在大多数微生物表现强势等原因，嗜热脂肪芽孢杆菌孢子(ATCC 7953)已成为目前验证湿热灭菌程序的最常用的生物指示剂。采用该菌株进行灭菌工艺验证通常不再需要企业提供连续两年的微生物环境监测结果。验证过程通常为将一定量已知耐热性的孢子接入产品中，用设定的灭菌程序灭菌，以确认设定的灭菌工艺是否符合标准。由于部分产品可能会增加微生物的耐热性或可能会杀灭微生物或与之不相容等情况，当产品杀灭或与菌种孢子不相容时，可考虑使用生理盐水或与产品相似的溶液替代产品进行验证。因此在灭菌程序之前了解生物指示剂在产品或替代产品中的耐热性是必要的。
生物指示剂的使用方法
将生物指示剂按照使用要求放置于产品内部、产品包装、溶液内或灭菌最难达到的位置，负载灭菌应放置足够数量的芽孢条，启动灭菌工艺进行灭菌。灭菌后取出灭菌后取出生物指示剂，进行培养。自含式生物指示剂需要在取出后压紧上盖，培养前压碎装有培养基的小玻璃瓶，和对照组一起竖立放置在56℃～58℃培养箱内培养，分别于24h观察初步结果，48h观察最终结果并记录。
对于芽孢条的培养需注意，嗜热脂肪芽孢培养温度为55℃，枯草芽孢和短小芽孢为35℃，时间为7天，方能报告阴性。
生物指示剂的实验室管理
生物指示剂质量报告内容应包括微生物种类、含量、D值、有效期等，实验室在使用前要对BI进行质量复核，进行微生物数量的确认，进行登记并按说明存放。
典型的微生物数量复核报告包含以下内容：BI含菌量确认、生产商、菌名、批号、标示含菌量、D值、效期、稀释过程、稀释倍数、计数结果、每个BI含菌量、是否合格等。可以将BI的产品质量报告或其复印件与上述文件一起存放。检验合格的BI要经过批准和发放后才可以使用。
参考资料
Ø WS/T 367-2012 中华人民共和国卫生行业标准 医疗机构消毒技术规范
Ø ISO 11138-1Sterilization of health care products – Biological indicators – Part 1 : Generalrequirements.
Ø CHP 2010
Ø USP 32 <55>《BIOLOGICALINDICATORS-RESISTANCE PERFORMANCE TESTS》；
Ø USP 32<1035>《BIOLOGICAL INDICATORS FOR STERILIZATION》
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