保藏微生物的目的是要使微生物不死、不变、不污染。任何保藏 方法，其基本原理总是要求使微生物保持休眠状态，主要措施是低温、干燥和缺氧。

1. 斜面移种法在室温下保藏，容易引起微生物生长缓慢而衰老，因此，必须经 常移种。一般来讲，移种的次数越多，发生变异的可能性也越大。

  为了克服保藏条件的不足，可采用石蜡封固，这样能控制空气流通，迫 使微生物处于休眠状态，显著延长保藏期。一般生产食醋的工厂，都要经常移种斜面菌种。可将已生长好的琼 脂试管菌种，放置在2〜4°C的冰箱中保藏。一般保藏期为曲霉菌3〜4个月移种一次；根霉菌1〜2个月移种一次；酵母菌2〜3个月移种一次; 醋酸菌、乳酸菌每月移种一次；有些弱小的菌种，则要14d移种一次。

  2. 低温保藏法低温保藏通常指在一20°C保藏。因为在0〜30°C范围内，可能出 现水与电解质共晶混合物，这就有可能损害菌体的存活性。还有一种超低温保藏，是把菌种放在有液氮的超低温冰箱中。所 谓超低温是指一 196〜一 150°C之间，这是近代国际上发展的一项新技术。

  理论上认为，在液态氮的低温下，菌种不会发生遗传变异。

3. 矿油保藏法矿油又称液体石蜡。矿油保藏法是将矿油装人三角瓶，加棉塞， 于0。1MPa、30min灭菌，在40°C烘去水分；然后，在无菌操作下，用无菌吸管灌注矿油，矿油液面高出菌种斜面1〜1。

  5cm，在试管架上直立保藏，在室温或冰箱中可以保藏6个月至1年。使用时取出， 倒去矿油，再移种到新鲜斜面培养基中即可。该法可以成功地保存酵母菌、毛霉菌、曲霉菌等许多微生物。

4. 干燥保藏简单的干燥保藏法，是把微生物菌体混于灭菌的沙土中装入试 管，管口加棉塞，用石蜡熔封。

  灭菌的硅胶片、纸片、麸皮或其他类似物，也可以像沙土一样用来保藏菌种。

(1) 沙土管保藏法。该法适用于产生孢子的霉菌和细菌，对保藏芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌更合适。

① 取河沙：用60号筛除去大粒沙，再用10%的盐酸溶液浸泡2〜4h，清水洗净至pH呈中性；放入铁锅中用大火炒干，或在160〜 180°C烘箱中烘干，装人试管（如河沙和土按2: 1混合装管），每管 装人沙土 0。

   5〜1。0cm高，加棉塞，于O。IMPa灭菌lh。

② 孢子悬浮液的制备：在无菌操作下，刮取细菌或霉菌孢子，接入无菌水中，制成孢子悬浮液。有的微生物如霉菌等，可以直接刮取 孢子接种于沙土管中。

③ 真空干燥：在无菌操作下，接种孢子悬浮液10滴于沙土管中，加棉塞，在放有氯化钙的真空干燥器中抽成真空，一般以外观沙粒疏 散不结团为止。

  棉塞用石蜡培封，即可保存。

(2) 冻干法。常用冷冻真空干燥保藏法，该法具备低温、真空、干燥三个条件，适用于各类微生物的保藏。用这种方法保藏的菌种存 活率高，变异率低，保存时间可长达1〜20年之久。方法：将装有菌液的安瓿瓶置于干冰内，使其呈冻结状，用抽气 机进行减压抽气干燥。

  为防止微生物因过度冷却而死亡，可加入一定的保护剂，如脱脂牛乳和血清等。用保护剂洗下斜面上生长的菌体， 制成菌悬浮液，接入安瓿瓶中约O。lmL，塞上棉花，用橡皮管的一 端连接安瓶瓶，置于一个干冰容器中；橡皮管的另一端连接真空表的三通管，用真空泵抽气约lOrnin，使管内物质骤然冷却，全部冻结。

  半小时后，安瓿瓶内压力可降至3。 3Pa以下，将安瓶瓶移人-15°C的 冰盐水中，继续真空抽气lh。然后，将安瓿瓶置于室温中，管内物 质全部干燥，呈疏松状，用煤气喷灯封安瓿瓶颈部，再用高频火花真 空检测器检测真空状态，管内有蓝色者为合格。置4°C冰箱中保存。