药  品： 1、平板计数琼脂 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤（LST） 3、煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB） 4、氯化钠 设备材料： 烧杯 、三角瓶、广口瓶、培养皿、刻度吸管、倒气管、玻璃棒、试管、硅胶塞、洗耳球、棉花、布或报纸等。 一、 准备工作 （指导书是按一个样品所需物品准备的，实验室可按样品量增加） 1、平板计数琼脂培养基准备----用于菌落总数测定    将三角瓶放在电子称上，去皮，按平板计数琼脂使用说明称量，加200ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸加热煮沸，充分溶解，盖上硅胶塞，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧。 2、月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤----用于大肠菌群测定 （a）将烧杯放在电子称上，去皮，按使用说明称量，加100ml蒸馏水搅拌，放电炉上煮沸，充分溶解。 （b）用10ml（毫升）的吸管分装到9支(18*180规格)试管中，每支试管加10ml的月桂基溶液LST（合计90毫升）。 （c）9支试管分别放入倒气管（开口向下），排气，盖上硅胶塞。 3、0.85%的生理盐水----用于样品稀释 将广口瓶去皮，称取氯化钠1.91g加225ml蒸馏水，摇匀，用报纸或布包好，再用橡皮筋扎紧； 同样配制第二瓶。 4、准备2个空试管，盖上硅胶塞----用于样品稀释。 5、准备8个培养皿，用布包扎好。 6、准备至少3支5ml和1支10ml带有刻度的吸管，用布包扎好（顶部可用棉球塞住，防止吸液时，液体不慎吸入洗耳球）。 7、准备操作的工具：剪刀1把、镊子1个、勺子等打开产品包装所需工具，用布包扎好。 二、使用灭菌锅灭菌     1、检查灭菌锅底部加热管水位是否正常，水位要高过加热丝。     2、将上面准备好的7步骤物品逐一放入锅内，注意：滴定管吸口向下，有棉球的向上。     3、盖上灭菌锅盖子时，将排气管插到排气口内，注意从对角线开始拧紧螺丝，将排气阀打开（安全阀始终关闭），通电后，待排气阀放气3分钟后（锅内冷空气已经排完），关闭排气阀。     4、查看灭菌锅的压力表，当温度升到121°，压力升到0.1MP(兆帕)时，灭菌维持15分钟后(温度和压力不能过高或者过低)，断电自然冷却到接近“0”度后，慢慢打开排气阀，再对角拧开灭菌锅。 三、无菌操作     进无菌室前的准备：放好工具（酒精灯，记号笔，消毒用75%酒精棉球，洗耳球，电子称），打开紫外线杀菌灯，杀菌30分钟后关闭，再等10分钟后进入无菌室。（无菌室缓冲间应放有：白色衣服、帽子、鞋子和口罩等）。     1、待灭菌锅自然冷却后，取出6件灭菌好的物品，留下平板计数琼脂培养基(PCA)在灭菌锅里待用（该液体凉后会凝固，应保持温度50℃左右）。 2、用75%的酒精棉球消毒手和操作台面。 3、点着酒精灯，准备接种，接种过程在酒精灯周围10cm范围进行。 4、无菌操作       A、拿出第一瓶生理盐水，用10毫升的吸管分别吸9ml生理盐水加入2个空的试管中，再吸1ml的生理盐水，放入1个培养皿内（这是生理盐水空白试验用的）。（10ml吸管使用3次，不再使用）   B、准备制样，用75%的酒精棉球擦拭样品包装准备开口处，拿出第二瓶生理盐水，放在电子称上，去皮，称取或量取25g（mL）样品，放入225ml生理盐水中充分摇匀，制成稀释10倍的检测样品，即10-1溶液。（注意摇匀）（见书中最后1页图）      C、取出第一个5ml的吸管，吸取5ml的“检测样品10-1溶液”，分别放入2个培养皿和3个试管中，各放1ml，再吸取1ml“检测样品10-1溶液”放入9ml生理盐水的试管中，制成稀释100倍的检测样品，即10-2溶液。（注意摇匀）     D、取出第二个5ml的吸管，吸取5ml的“检测样品10-2溶液”，分别放入2个培养皿和3个试管中，各放1ml，再吸取1ml放入9ml生理盐水的试管中，形成稀释1000倍的检测样品，即10-3溶液。（注意摇匀）     E、取出第三个5ml的吸管，吸取5ml的“检测样品10-3溶液”，分别放入2个培养皿和3个试管中，各放1ml。（注意摇匀）（详见书中最后1页图）。 F、取出灭菌锅内的三角瓶（平板计数琼脂培养基(PCA)），用手感觉瓶子热度（以45-50度为宜，过热或过低均不行），分别倒入8个培养皿内15-20ml平板计数培养基，注意倒入时仅拿开一点点盖子，并在酒精灯边上操作，左右摇匀，待平板计数培养基凝固后，倒置培养皿。其中有1个培养皿是用于做平板计数培养基空白试验的。 四、培养     要求培养箱温度在（36±1）度，培养时间在（48±2）小时，将8个培养皿（倒置）和9个试管均放入培养箱内进行培养。 五、检查结果、计算 （1）计算大肠菌群： 培养24h取出9个试管，观察是否有产酸产气现象，浑浊即为产酸、倒气管悬空即为产气，有几个试管产酸产气，即准备做几个煌绿乳糖胆盐肉汤试管，煌绿和月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤，做法同样！即：看药品使用说进行配制，称量--煮沸溶解--分装--加入倒气管--排气--塞硅胶塞--灭菌备用。 1类结果：均无产酸产气现象，继续培养24h， 检验值是：<30MPN/100g。 2类结果：煌绿试管有产酸产气现象，查看各稀释度产酸产气个数，对照书中“倒数第2页”表格，找出结果后乘以100，再保留2位有效数字（例如：4.3×102） （2）计算菌落总数： 取出8个培养皿，逐一观察，不论菌落大小，连在一起的计算为1个，如果菌落比较多，可以分成4个区来计数。 1类结果：空白试验的2个培养皿，发现菌落，则环境污染了，本次试验失败。 2类结果：对照书“第3页-第4页”，有6种可能出现的情况，对照对应情况进行计算。 注意：菌落数适宜计数范围是：30--300个/培养皿。       菌落总数检验值：保留两位有效数，例如：6.1×102，即为610 CFU/ml