01操作前准备

将接种环2支，酒精灯2个，打火机2个，无菌平板两包，酒精棉球2瓶，镊子2个，洁净烧杯2个置于超净工作台，打开紫外灯，灭菌30分钟。

取待纯化菌种2支放入超净工作台。操作者直立坐于操作台前，打开操作台玻璃，高度可供双手顺利出入即可。

02擦拭

用镊子取酒精棉球擦拭双手，在超净工作台门口处，并将台面擦出与肩同宽的正方形区域，此区域即为操作区域。将用毕的棉球放入烧杯中。


03物品摆放

将酒精灯放于擦拭区域的中心，将接种环放于酒精灯的右侧，将菌种放于酒精灯的左侧，将无菌平板的包装除去，包装置于操作区外，无菌平板置于酒精灯左侧。


04点燃酒精灯

打开酒精灯盖，将盖扣于离开操作区的台面上，点燃酒精灯，酒精灯周围3-5cm之内即为无菌区。

05灼烧接种环

右手持接种环，将接种环的金属丝直立于酒精灯外焰处，灼烧至红透，然后略倾斜接种环，灼烧金属杆，注意灼烧时要将金属丝与金属杆的连接部分充分灼烧。

06取菌种

左手持斜面的底部，将管口置于火焰的无菌区，右手小指打开试管塞，将接种环的接种丝放于外焰处再次灼烧至红透，然后将其深入试管内部，稍微凉一下，轻轻取一环，勿划破培养基，将接种环从试管中取出，注意取时勿碰触试管壁。将试管塞灼烧一圈，塞于试管上。因试管口一直在火焰的外焰处，故其温度较高，塞试管塞时注意勿烫手。

07接种

左手取无菌平板一个，用拇指和食指控制皿盖，其余几指控制皿底，打开皿盖，使开口角小于30°，将接种环上的菌种按图示进行划线，一区法要求连续划线，且线的边缘应划至培养皿的内缘，线要紧密但不相连。三区或四区法要求每划完一区，都应灼烧接种环，后一区要求与前一区首尾相连，但不得与其他区域搭在一起。具体的划线顺序如下图：


08培养

将接种完毕的平板放于恒温培养箱中倒置培养。

09整理台面

操作完毕后，将实验所需的物品放回原处，并将实验所产生的垃圾清理干净，带出超净台，放于垃圾桶中。

10结果观察

72小时后，观察平板，应无杂菌污染，若菌种不在划线的线上则为杂菌；线应为直的，且每一线都接近平板边缘，平行的线和线之间要紧密，但不能搭在一起；要有较多的单菌落，至少应有10个以上的单菌落方为合格。